Rhizobium ; Bakteri symbiotik penambat N

I. PENDAHULUAN

1.1 Penambatan Nitrogen

Nitrogen adalah unsur yang diperlukan untuk membentuk senyawa penting di dalam sel, termasuk protein, DNA dan RNA. Tanaman harus mengekstraksi kebutuhan nitrogennya dari dalam tanah. Sumber nitrogen yang terdapat dalam tanah, makin lama makin tidak mencukupi kebutuhan tanaman, sehingga perlu diberikan pupuk sintetik yang merupakan sumber nitrogen untuk mempertinggi

produksi. Keinginan menaikkan produksi tanaman untuk mencukupi kebutuhan pangan, berakibat diperlukannya pupuk dalam jumlah yang banyak.

Industri pupuk yang ada belum dapat memenuhi kebutuhan pupuk yang semakin meningkat. Untuk itu perlu dicari pupuk nitrogen alternatif dan rekayasa gen hijau kelihatannya dapat memberikan harapan untuk memenuhi kebutuhan pupuk di masa yang akan datang. Udara yang menyelubungi bumi mengandung gas nitrogen sebanyak 80 %, sebahagian besar dalam bentuk N yang tidak dapat dimanfaatkan. Tanaman dan kebanyakan mikroba tidak mempunyai cara untuk mengikat nitrogen menjadi senyawa dalam selnya. Tanaman dan mikroba umumnya mendapatkan nitrogen dari senyawa seperti ammonium (NH₄⁺⁾ dan nitrat (NO₃^-). Untuk memanfaatkan nitrogen dalam bentuk gas, pakar bioteknologi memusatkan perhatiannya pada hubungan antara tanaman dengan jenis mikroba tertentu yang dapat menambat nitrogen dari udara dan menyusun atom nitrogen kedalam molekul ammonium, nitrat, atau senyawa lain yang dapat digunakan oleh tumbuhan (Prentis, 1984).

Tanaman kacang-kacangan seperti buncis dan kedelai, akarnya mempunyai bintil– bintil berisi bakteri yang mampu menambat nitro gen udara, sehingga nitrogen tanah yang telah diserap tanaman dapat diganti. Simbiosis antara tanaman dan bakteri saling menguntungkan untuk kedua pihak. Bakteri mendapatkan zat hara yang kaya energi dari tanaman inang sedangkan tanaman inang mendapatkan senyawa nitrogendari bakteri untuk melangsungkan kehidupannya. Bakteri penambat nitrogen yang terdapat didalam akar kacang-kacangan adalah jenis bakteri Rhizobium. Bakteri ini masuk melalui rambut-rambut akar dan menetap dalam akar tersebut dan membentuk bintil pada akar yang bersifat khas pada kacang – kacangan. Belum diketahui sepenuhnya bagaimana rhizobium masuk melalui rambut – rambut akar, terus ke dalam badan akar dan selanjutnya membentuk bintil – bintil akar.

Tabel 1. Beberapa spesies Rhizob ium dan tanaman simbiosanya

Spesies Rhizobium

Tanaman Simbiosisnya

R. leguminasorumR. phaseoliR. trifolii

R. melioti

R. lupini

R. japonicum

Rhizobium. spp

Pea (Pisum spp), lentil ( Lens culinaris)Kacang buncis (Phaseolus vulgaris)Clover ( Trifolium subteranim)

Alfafa (Medicago sativa)

Lupin (Lupinus, spp)

Kedelai ( Glycine max)

Cowpea (Vigna, spp), kacang tanah (Desmodium spp)

Untuk menambat nitrogen, bakteri ini menggunakan enzim nitrogenase, dimana enzim ini akan menambat gas nitrogen di udara dan merubahnya menjadi gas amoniak dan kemudian asetylen menjadi ethylen. Gen yang mengatur proses penambatan ini adalah gen nif (Singkatan nitrogen – fixation). Gen – gen nif ini berbentuk suatu rantai , tidak terpencar kedalam sejumlah DNA yang sangat besar yang menyusun kromosom bakteri, tetapi semuanya terkelompok dalam suatu daerah. Hal ini memudahkan untuk memotong bagian untaian DNA yang sesuai dari kromoson Rhizobium dan menyisipkanya ke dalam mikroorganisme lain (Prentis, 1984). Dengan rekayasa genetik telah berhasil ditransfer gen nif dari bakteri Rhizobium kedalam bakteri Escherechia coli , sehingga E. coli mampu untuk menambat nitrogen. Beberapa kelompok bakteri yang dapat dimanfaatkan untuk meningkatkan produksi tanaman adalah : (a) Rhizobium (bakteri penambat N2 yang bersimbiosis dengan kacang – kacangan, (b) Azotobakter, Azospirillum (bakteri penambat N2 yang tidak bersimbiosis dengan tanaman, (c) Bacillus subtilis, B. polymixa (bakteri penghasil senyawa yang dapat melarutkan fosfat tanah), (d) Clostridium dan (e) Pseudomonas fluorescens dan P. putia. Potensi penggunaan rizobakteria sebagai inokulan telah banyak mendapat perhatian dari pakar mikrobiologi tanah dan penyakit tanaman, karena sifat dari rizobakteria ini sangat agresif dalam mengkolonisasi akar menggantikan tempat mikroorganisme yang dapat menimbulkan penyakit pada tanaman. (Burr, 1978). Hubungan antara tanaman dan mikroorganisme terjadi di daerah rizosfer, mikroorganisme dapat hidup dari substrak yang dikeluarkan oleh tanaman melalui akar ataupun tanaman yang mati, disamping itu dapat juga merangsang pengeluaran unsur hara dari akar (Vancura, 1964), dapat menghasilkan senyawa – senyawa yang mempercepat pertumbuhan (Bowen dan Rovira, 1961).

Beberapa keuntungan dengan memanfaatkan kelompok mikroorganisme ini

adalah :

tidak mempunyai bahaya atau efek sampingan,
Efisiensi penggunaan yang dapat ditingkatkan sehingga bahaya pencemaran lingkungan dapat dihindari,
harganya yang relatif murah
Teknologinya yang sederhana. Pemanfaatan kelompok mikroorganisme ini telah diterapkan di negara – negara maju dan beberapa negara berkembang.

1.2 Mikrobia penambat nitrogen

Sumber utama N berasal dari gas N2 dari atmosfir. Kadar gas nitrogen di atmosfir bumi sekitar 79% dari volumenya. Walaupun jumlahnya sangat besar tetapi belum dapat dimanfaatkan oleh tanaman tingkat tinggi, kecuali telah menjadi bentuk yang tersedia. Proses perubahan tersebut: (1). Penambatan oleh mikrobia dan jazad renik lain. Jazad renik ada yang hidup simbiotis dengan tanaman tanaman legum (kacang-kacangan) maupun tanaman non legum, (2). Penambatan oleh jazad-jazad renik yang hidup bebas di dalam tanah atau yang hidup pada permukaan organ tanaman seperti daun, dan (3). Penambatan sebagai oksida karena terjadi pelepasan muatan listrik di atmosfir.

Jumlah nitrogen yang ditambat oleh rhizobia sangat bervariasi tergantung strain, tanaman inang serta lingkungannya termasuk ketersediaan unsur hara yang diperlukan. Selandia Baru merupakan negara yang sangat mementingkan penggunaan pupuk nitrogen berasal dari penambatan N dari atmosfir.

Banyak genus rhizobia yang hanya dapat hidup menumpang pada tanaman inang tertentu (spesifik). Sebagai contoh bakteri yang bersimbiosis dengan kedelai (Soybean) umumnya tidak dapat bersimbiosis dengan dengan tanaman alfalfa (Medicago). Agar kemampuan menambat nitrogen tinggi maka tanaman inang harus dinokulasi dengan inokulan yang sesuai.

Fiksasi nitrogen sangat penting untuk lingkungan dan pertanian berkelanjutan (Sustainabele agriculture). Sebagian besar tanaman mengasimilasi nitrogen hanya dari tanah melalui penambahan pupuk. Sumber alternatif lain adalah Rhizobia yang mampu meyebabkan pembentukan nodula pada akar dari tanaman legum sebagai tanaman inang. Organ tanaman khusus diserang oleh bakteria yang memfiksasi nitrogen dalam keadaan bakteroid endosimbiotik dalam sel tanaman. Proses ini melibatkan pengenalan spesifik dan diferensiasi berkembang baik bakteri dan sel tanaman inang. Rhizobia berhadapan dengan bermacam-macam kondisi lingkungan seperti bakteria yang hidup bebas dalam tanah, selama proses infeksi dan seperti diferensiasi bakteroid dalam sel tanaman. Kapasitas rhizobia untuk beradaptasi terhadap perubahan kondisi lingkungan adalah sangat penting untuk keberadaanya dalam ekosistem dan interaksi simbiotik.

II. SIMBIOSIS RHIZOBIA DAN TANAMAN LEGUM

2.1 Taksonomi Rhizobia

Spesies yang terdaftar disini hampir semua valid/sah yang dipublikasikan namanya sebagai Rhizobia, yang mana berisi 62 spesies yang ditemukan dalam 12 genera. Rhizobia adalah bakteri pemfiksasi nitrogen yang membentuk nodula akar dalam tanaman legum. Hampir semua spesies bakteria ini adalah family Rhizobiaceae dalam alpha-proteobacteria dan salah satunya Rhizobium, Mesorhizobium, Ensifer atau genera Bradyrhizobium. Bagaimanapun, penelitian akhir-akhir ini telah menunjukkan bahwa terdapat spesies lain dari Rhizobia ini.

Dalam beberapa kasus spesies baru ini telah membangun melalui transfer gen lateral dari gen simbiotik. Genus Rhizobium (Frank, 1889) awal mulanya berasal dari bahasa latin yang artinya hidup di akar dan untuk beberapa tahun ini merupakan genus untuk semua Rhizobia. Beberapa spesies kemudian pindah menjadi genera baru berdasarkan analisis pilogenetik. Dan sekarang ini meliputi 16 spesies.

1. Rhizobium

Rhizobia adalah kelompok organisme yang sangat kecil (mikroorganisme) yang hidup di dalam tanah. Rhizobia adalah bakteria yang bersel satu/tunggal, panjangnya sekitar 1.000 mm.

1. Rhizobium cellulosilyticum

2. Rhizobium daejeonense 3. Rhizobium etli4. Rhizobium galegae

5. Rhizobium gallicum

6. Rhizobium giardinii

7. Rhizobium hainanense

8. Rhizobium huautlense

9. Rhizobium indigoferae

10. Rhizobium leguminosarum

11. Rhizobium loessense

12. Rhizobium lusitanum

13. Rhizobium mongolense

14. Rhizobium sullae “

15. Rhizobium tropici

16. Rhizobium undicola

17. Rhizobium yanglingense

New 28/3/07 (García-Fraile et. al. 2007) corrected 17/12/06Type speciesformerly “Rhizobium hedysari

formerly “Rhizobium huanglingense“

formerly Allorhizobium undicola

2. Mesorhizobium

Genus Mesorhizobium digambarkan oleh Jarvis et al. in 1997.. beberapa Spesies pindah dari Rhizobium ke dalam genus ini. Sekarang ini ada sekitar 11 spesies.

1. Mesorhizobium albiziae Baru 11-6-07 (Wang et. al., 2007)

2. Mesorhizobium amorphae

3. Mesorhizobium chacoense

4. Mesorhizobium ciceri dahulu Rhizobium ciceri

5. Mesorhizobium huakuii dahulu Rhizobium huakuii

6. Mesorhizobium loti dahulu Rhizobium loti, Type species

7. Mesorhizobium mediterraneum dahulu Rhizobium mediterraneum

8. Mesorhizobium plurifarium

9. Mesorhizobium septentrionale (ref)

10. Mesorhizobium temperatum (ref)

11. Mesorhizobium tianshanense dahulu Rhizobium tianshanense

3. Ensifer (dahulu Sinorhizobium)

Genus Sinorhizobium dipublikasikan oleh Chen et al. in 1988. beberapa studi akhir-akhir ini menunjukkan bahwa Sinorhizobium dan genus Ensifer (Casida, 1982) berada pada takson tunggal. Ensifer adalah sinonim heterotypic pertama dan kemudian menjadi prioritas (young, 2003). Ini artinya bahwa semua Sinorhizobium spp. harus berubah nama menjadi Ensifer spp mengikuti kode bakteriologi. Taksonomi dari genus ini diuji tahun 2007 oleh Martens et. al. Genus ini sekarang berjumlah 15 spesies.

Ensifer abri Spesies ini berbeda dari Ensifer adhaerens, tetapi belum bisa dianamai Ensifer
Ensifer americanum
Ensifer arboris
Ensifer fredii Formerly Rhizobium fredii, Type species
Ensifer indiaense Spesies ini berbeda dari Ensifer adhaerens, tetapi belum bisa dianamai Ensifer
Ensifer kostiense
Ensifer kummerowiae
Ensifer medicae
Ensifer meliloti formerly Rhizobium meliloti
Ensifer mexicanus New 19-2-07 (Lloret et. al. 2007)
‘Sinorhizobium morelense’
Ensifer adhaerens Spesies ini juga dikenal sebagai Sinorhizobium sahelense
Ensifer saheli Spesies ini salah diketahui sebagai Sinorhizobium teranga
Ensifer terangae Meskipun spesies ini telah dipublikasikan (Ogasawara, et. al. 2003), tetapi melum dimasukkan ke daftar sah (“Validation List”) International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology.

15. Ensifer xinjiangense

4. Bradyrhizobium

Genus Bradyrhizobium dipublikasikan oleh Jordan tahun 1982. Sekarang ini meliputi 5 spesies.

1. Bradyrhizobium elkanii

2. Bradyrhizobium japonicum formerly Rhizobium japonicum, Type species

3. Bradyrhizobium liaoningense

4. Bradyrhizobium yuanmingense

5. Bradyrhizobium canariense

5. Azorhizobium

Genus Azorhizobium dipublikasikan oleh Dreyfus et al. tahun 1988. Sekarang ini meliputi 2 spesies;

1. Azorhizobium caulinodans Type species

2. Azorhizobium doebereinerae formerly Azorhizobium johannae

6. Methylobacterium

Genus Methylobacterium sekarang ini hanya berisi spesies rhizobial. Methylobacterium nodulans

7. Burkholderia

Genus Burkholderia sekarang ini berisi lima nama anggota rhizobial dan lainnya sebagai Burkholderia sp.

1. Burkholderia caribensis

2. Burkholderia cepacia

3. Burkholderia mimosarum Baru 3/11/06

4. Burkholderia phymatum

5. Burkholderia tuberum

8. Cupriavidus : Cupriavidus dahulunya adalah Wautersia, formerly Ralstonia, yang baru-baru ini mengalami beberapa revisi taksonomi. Genus ini berisi spesies rhizobia tunggal. Cupriavidus taiwanensis

9. Devosia

Genus Devosia hanya berisi spesies rhizobia tunggal. Devosia neptuniae

10. Herbaspirillum

Genus Herbaspirillum sekarang ini berisi spesies rhizobia tunggal. Herbaspirillum lusitanum

11. Ochrobactrum

Genus Ochrobactrum sekarang ini berisi dua spesies rhizobia tunggal.

1. Ochrobactrum cytisi baru 28/3/07 (Zurdo-Piñeiro et. al. 2007)

2. Ochrobactrum lupini

12. Phyllobacterium

Genus Phyllobacterium sekarang ini berisi dua spesies rhizobia tunggal.

Phyllobacterium trifolii

2.2. Morfologi dan Sitologi Rhizobium

Sel muda mengandung zat warna, merata kecuali strain dari R. Leguminosaarum dan R. trifolii sering berisi granule metachromatic. Sel yang tua umumnya lebih lama dalam mengabsorbsi warna dan unstainde area dari polihydroksi butirat (PHB) yang menandai morfologi. Sel muda bergerak dengan flagella yang salah satunya bisa secara polar atau peritritious. Rhizobia muda, pada media kultur berbentuk batang dan menjadi bakteroid dibawah kondisi tertentu, serupa dengan bentu rhizobia pada nodula.

2.3 Proses masuknya Rhizobium ke dalam Akar Legum

Rhizobium masuk ke dalam akar legum salah satunya melalui rambut akar atau secara langsung ke titik munculnya akar lateral. Akar yang atau pengontrol tumbuh dan cabang rambut akar adalah respons tanaman pertama yang dapat terlihat karena terinfeksi rhizobium. Meskipun demikian, nodula tanaman legum umumnya nampaknya mengandung hanya satu strain dari Rhizobium menjadikan akar tanaman dapat membentuk nodula dengan lebih dari satu strain.

Dilaporkan bahwa strains Rhizobium mampu menginfeksi legum dengan

melepaskan polisakarida spesifik yang menyebabkan lebih banyak aktivitas pektolitik oleh akar. Beberapa berpendapat bahwa robekan mekanik dengan rhizobium masuk ke dinding rambut akar yang pecah. Rhizobium juga bisa terperangkap sampai membungkus rambut akar yang telah berubah bentuk.

Bagaimana sebenarnya nodula dibentuk ? Infeksi benang masuk dan berpenetrasi ke dalam akar dari sel ke sel. Sel ini terbagi membentuk jaringan nodula dimana bakteria ini terbagi dan menggandakan diri. Batas pemisah berkembang, lokasi pusat dimana bakteria berada, jaringannya dinamakan zona bakteria yang ditandai dengan nodula dari bakteria yang nenyerangnya- jaringan bebas dinamakan korteks nodula. Jaringan nodula tumbuh dalam berbagai ukuran, mendorong dirinya melalui akar dan kemudian muncul sebagai tambahan dalam sistem perakaran. Ukuran dan bentuknya bergantung pada spesies dan tanaman legumnya.

Ada dua tipe nodula, yaitu efektif dan inefektif. Nodula efektif dibentuk oleh strains efektif dari Rhizobium. Nodula ini berkembang dengan baik, berwarna merah muda akibat adanya pigmen leghaemoglobin. Jaringan bakteroid berkembang baik dan terorganisasi dengan baik dengan banyak bakteroid. Berbeda dengan strain inefektif dari Rhizobium bentuk nodula inefektif umumnya kecil dan berisi sedikit jaringan bakteroid yang berkembang, menunjukkan akumulasi tepung dalam sel tanaman inang yang tidak berisi Rhizobium. Bakteroid dalam nodula inefektif berisi glikogen.

2.4. Proses pembentukan Nodula pada Tanaman Legum oleh Rhizobium

Tanaman legum dalam kondisi ternodulasi oleh bakteri pemfiksasi N bersimbiosis dengan bakteria tanah dari genus Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium, Mesorhizobium and Sinorhizobium. Interaksi antara bakteri rhizobium dengan tanaman legum dikendalikan oleh tanaman inang tertentu. Misalnya S. meliloti membentuk nodule pada alfafa dan B. japonicum membentuk nodula pada kedelai. Tanaman inang nya tertentu, ditentukan dengan paling sedikit dua tahap perubahan sinyal yang saling bergantian antara tanaman dan mikrosimbiotik (Gambar 8).

Pertama, gen bakteri nodulasi (nod) aktif dalam merespons sinyal molekul yang dikeluarkan tanaman seperti flavonoids, dihasilkan dari biosintesis dan sekresi lipochitooligosaccharides (LCOs) oleh bakteri rhizobium. Tahap kedua, LCOs mendatangkan bentuk nodul pada akar tanaman inang dan memicu proses infeksi. LCOs yang menyebabkan bentuk akar bernodula pada tanaman inang dinamakan factor Nod.

2.5. Peran Nitrogenase dalam Proses Fiksasi Nitrogen

Fiksasi Nitrogen dilakukan oleh bakteri. Bakteri ini menyelenggarakan fiksasi nitrogen yang terjadi baik oleh bakteri yang hidup bebas atau hidup bersimbiosis dalam akar tanaman legum seperti kedelai, clover, dan buncis. Fiksasi Nitrogen ini melibatkan penggunaan ATP dan proses reduksi ekivalen berasal dari metabolisme primer. Semua reaksi yang terjadi dikatalisis oleh nitrogenase. 8H+ + N2 + 8 e + 16 ATP + 16 H2O  2 NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi + 16 H+

Nitrogenase adalah dua protein kompleks. Satu komponen, dinamakan nitrogenase reduktase (NR) adalah besi (Fe) berisi protein yang menerima elektron dari ferredoxin, reduktat kuat, dan kemudian mengirimkannya kekomponen lainnya dinamakan nitrogenase atau M0Fe protein (Iron-Molybdenum Protein).

Cukup banyak sistem fiksasi nitrogen berisi enzim, hydrogenase, yang memanen elektron dari molekul hidrogen dan mentransfernya kembali ke dalam Nitrogenase pertama kali menerima elektron dari NR dan proton dari larutan. Nitrogenase mengikat molekul dari molekul nitrogen (melepaskan H2 pada waktu yang sama) , dan kemudian menerima elektron dan proton dari NR, menambahkannya ke dalam molekul N2, akhirnya melepaskan dua molekul amoniak NH3. Melepaskan molekul hidrogen, H2, rupanya adalah bagian yang hakiki dari fiksasi nitrogenferredoxin, kemudian menyimpan beberapa energi metabolik yang hilang selama reduksi nitrogen.

Bagian utama dari energi fotosintesis dalam tanaman yang bernodula digunakan untuk fiksasi N2. Paling tidak enam belas molekul ATP dihidrolisis selama reduksi oleh molekul nitrogen tunggal. Pengeluaran energi dari fotosintesis sama sekali membatasi pertumbuhan tanaman yang memfiksasi nitrogen. Contohnya, hasil penggunaan energy (protein, karbohidrat, dan minyak) dari lahan jagung lebh banyak daripada dari lahan kedelai.

Nitrogen sangat sensitif terhadap oksigen. Akar bernodula dari tanaman

pemfiksasi nitrogen berisi oksigen- mengikat protein, leghemoglobin, yang melindungi nitrogenase melalui pengikatan molekul oksigen. Mekanisme serupa dilakukan dalam nitrat reduktase dan nitrit reduktase. Kedua substansi ini dihasilkan dari ammonia melalui proses oksidasi. Bakteri tanaman dan tanah dapat mereduksi senyawa ini untuk menyediakan ammonia untuk metabolisme. Pupuk yang umum digunakan seperti ammonium nitrat, NH₄NO₃, menyediakan reduksi

nitrogen untuk pertumbuhan tanaman secara langsung, dan menyediakan substrat

untuk reduksi nitrat. NADH atau NADPH adalah donor elektron untuk nitrat reduktase, bergantug pada organismenya.

Langkah pertama adalah reduksi nitrat menjadi nitrit

NO3- + NADPH + H+ è NO2- + NADP + H2O

Langkah kedua melibatkan nitrat reduktase yang mereduksi nitrit menjadi ammonia

NO2- + 7 H+ + 6 e è NH3 + 2H2O

NO- (nitrit) dan NH2OH (hydroxylamine) lanjutan dalam reaksi tetapi tidak

berdisosiasi dengan nitrit reduktase.

2.6 Teknik Kultur Rhizobium

Bahwa sedikit sekali jenis prokariotik yang dapat menfiksasi nitrogen, termasuk beberapa Cyanobakteria (Ganggang Hijau Biru), sejumlah bentuk yang hidup bebas nonphototrofik dan beberapa bentuk simbiotik (seperti Rhizobium). Tetapi bagaimana kita dapat mengisolasi mikroba penambat nitrogen ? Untuk melakukan ini, kita akan menggunakan suatu teknik yang dikembangkan oleh ahli mikrobiologi untuk mengisolasi mikroba dengan kemampuan biokimia khusus. Teknik itu dinamakan Elective atau Enrichment culture technique .Hal ini didasari oleh oleh prinsip umum, yaitu jika kita ingin mengisolat mikroba yang memiliki karakteristik biokimia yang unik, kita harus menyediakan medium tertentu sehingga hanya mikroba dengan karakteristik tertentu dapat tumbuh. Langkah-langkah memproduksi inokulan diantaranya sebagai berikut :

2.6.1 ISOLASI STRAINS RHIZOBIUM

1. Mengumpulkan dan menyiapkan nodula akar di lapangan

Botol untuk sampel akar berisi silika gel untuk menghindari dari proses pembusukan dan mencegah dari serangan mikroorganisme tanah yang dapat mempengaruhi prosedur isolasi berikutnya. Kemudian akar yang bernodula dikumpulkan dan dimasukkan ke dalam botol yang ebrisi silika gel. Jika warna gel berubah menjadi merah muda/pink, desikan harus diganti oleh desikan biru secepat mungkin. Lalu berikan label yang berisi identifikasi sampel akar.

Hal yang perlu diperhatikan sebelum pengambilan sampling adalah :

a. Identifikasi lokasi

Negara, garis lintang dan garis bujur menggunakan GPS, kota terdekat pada

saat pengambilan sampling

b. Indentifikasi tanaman inang

Hal ini dianjurkan untuk dilakukan. Sampel tanaman legum diidentifikasi genus, spesies atau kultivarnya. Akan lebih baik bila kita mendokumentasikan tanaman legumnya. Jika ada kasus tanaman leguninosaseperti kedelai dan mung bean tumbuh di ladang petani, tanyakan varietas dari leguminosa tersebut dan konfirmasikan sejarah lahan/ladang tersebut berkaitan dengan inokulasi rhizobia.

c. Indentifikasi tanah

Mengumpulkan tanah dalam kantung plastil tertutup (ziplocs bag), dan

identifikasi tipe tanahnya, tekstur dan pH.

Mengumpulkan dan menyiapkan nodul akar

Menggali seluruh tanaman untuk mengambil bagian akar yang bernodula
Bersihkan tanah secara hati-hati disekitar akar yang bernodula
Lindungi Akar Yang Bernodula Dan Dikumpulkan Dengan menggunakan gunting.
Semua nodula yang berasal dari tanaman inang tunggal menwakili satu unit bahan yang dikumpulkan dan disimpan dalam botol yang sama. Akar bernodula yang berasal dari tanaman berbeda tetapi masih dalam satu spesie seharusnya tidak disatukan karena bisa saja berasal dari lingkungan tanah yang berbeda walaupun hanya beberapa meter saja jaraknya.
Botol yang berisi akar bernodula yang kering disimpan di lemari es pada suhu 5^oC

2. Isolasi dari nodula segar

Akar legum segar yang dikumpulkan dari lapangan dibersihkan dengan air untuk membuang semua tanah dan partikel organik. Dengan menggunakan gunting tang, akar yang terinfeksi nodula dipotong hingga 2-3 mm setiap bagian dari nodula, utuh dan tidak rusak. Lalu mencelupkannya selama 10 detik ke dalam etanol 95% atau isopropanol dipindahkan ke larutan sodium hypoklorit 2.5 – 3% (v/v) atau clorox 1 : 1 (v/v) dan rendam selama 4-5 menit.

Nodula dihancurkan dalam pipa steril dengan tangkai gelas steril dan air yang steril. Slurry ditambahkan air dan kemudian piring berisi lapisan pada permukaan YMA (Yeast Manitol Agar) berisi congo red. Cawan petri yang berisi inokulan diinkubasi pada suhu 25-280C selama 3 sampai 10 hari, bergantung pada strain dan penampakan koloni yang spesifik. Koloni rhizobia adalah mucoid, bundar/bulat dan menunjukkan sedikit atau tidak ada absorpsi congo red. Isolat dari koloni rhizobia tunggal kemudian dimurnikan dan disebut sebagai Rhizobium melalui demonstrasi kemampuan bentuk nodula pada percobaan legum tanaman inangh dibawah kondisi bakteriologis yang terkontrol.

Metode lain adalah isolasi menggunakan jarum. Metode jarum ini terutama

berguna apabila nodula segar dipanen berukuran 2 mm atau berdiameter besar. Nodula pertama kali dicuci menggunakan air, kemudian masukkan ke dalam alkohol dan dipegang menggunakan gunting tang dan lewatkan ke dalam api. Permukaan akan steril, nodule diletakkan ke dalam kertas saring steril (2×2 cm) dalam cawan petridis. Setiap kertas saring berlaku untuk satu jarum

2.6.2. Produksi Inokulan Rhizobium

1. Persiapan Media tumbuh “Air Kaldu”

Rhizobia relatif mudah untuk ditumbuhkan dalam medium liquid. Sejak

rhizobia tidak berkompetisi dengan mikroorganisme lain, sangat penting untuk

mensterilkan semua bejana tumbuh dan medium sebaik mungkin untuk meyakinkan inokulasi dengan starter rhizobia dibawa lingkungan yang steril. Hal ini dapat dipengaruhi oleh medium kultur, strains rhizobia, temperatur dan aerasi.

Rhizobia merupakan bakteri aerobik dan memerlukan oksigen untuk pertumbuhannya. Hasil penelitian menunjukkan bahwa produksi inokulan rhizobia memerlukan aerasi 5 -10 liter air untuk 1 liter medium dalam 1 jam. Temperatur

optimum untuk pertumbuhan rhizobia sekitar 28 – 300C. Medium mensuplai energi, nitrogen, mineral garam tertentu dan faktor tumbuh.

Medium Yeast Manitol (YM) yang umum digunakan dalam kultur air kaldu rhizobia. Komposisinya adalah sebagai berikut :

Bahan-bahan g l-1

KH2PO4 0.5

MgSO4. 7 H2O 0.1

NaCl 0.2

Manitol 10.0

Yeast Extract 0.5

Air destilasi 1.000 l

CHEMICAL PURPOSE/NUTRIENT AMT/LITER

d-mannitol Carbon source, Energy 10 gms

K2HPO4 Phosphate, Potassium 0.5 gms

MgSO4.7H2O Magnesium, Sulfur 0.1 gms

NaCl Sodium, Chlorine 0.2 gms

FeCl3.6H2O Iron 0.02 gms

Molybdic Acid Molybdenum 0.002 gms

CaCO3 Calcium 10 gms

Ditambah dengan air hingga satu liter

Ada juga yang menambahkan ekstrak ragi digunakan untuk suplement pertumbuhan bagi rhizobia. Alternatif lain adalah tepung segar dapat digunakan.

Untuk memproduksi “kultur air kaldu”, tempat atau bejana dalam berbagai

ukuran sering digunakan. Hal ini penting bahwa semua peralatan dalam keadaan steril dan “inlet air “ juga steril. Bejana diisi dengan media 1/3 sampai 2/3 dan disterilisasi pada autoclave . Kultur starter liquid diinokulasikan pada bejana dengan rasio 1-3 % (v/v) dari media. Waktu yang diperlukan untuk tumbuh rhizobia berada pada kisaran 3-7 hari, bergantung pada daya tumbuh strains rhizobia tersebut. Selama pertumbuhan rhizobia dalam starter dan kultur air kaldu sangat penting untuk melihat kontaminan dan mengontrol kepadatan rhizobia.

2. Produksi Carier Steril- Dasar Inokulan

Produksi memerlukan carrier/pembawa steril yang lengkap dalam paket steril. Cara sederhana adalah mencampurkan carier steril dengan kultur baketri liquid. Sterilisasi pendahuluan pada kantung pembawa/carier adalah dengan menyuntikkan zat aseptik pada kultur dengan jarum steril. Untuk produksi dalam skala besar , auto syringe” (automatic dispensing machine0) bias digunakan. Area tusukan harus didesinfeksi dengan etanol. Lubang bekas suntikan kemudia segera ditutup dengan label perekat. Kelembaban akhir dari inokulan seharusnya sekitar 45-50%. Setelah injeksi kantung yang berisi carier seharusnya 45-50%. Setelah penyuntikan, paket yang berisi carier harus ditempatkan pada temperatur dan area yang dikontrol tepat untuk membiarkan sel bakteri tumbuh mencapai populasi maksimum. Inokulan siap digunakan setelah 2 minggu. Ciri koloni bakteri Rhizobium utih bening, mengkilat, menonjol, tepian rata. Kontaminan (Agrobacterium) : warna merah

2.7 Teknik Inokulasi Rhizobium

Inokulum berisi bakteria yang harus senantiasa dijaga tetap hidup. Setiap paket yang berisi inokulum pada umumnya memiliki tanggal kadaluarsa. Setelah tanggal ini, bakteria tidak hidup dan inokulum seharusnya tidak diunakan lagi. Periode panas yang pendek dapat menurunkan jumlah Rhizobia yang hidup, paket yang berisi inokulum seharusnya disimpan di tempat dingin dan terhindar sinar matahari langsung. Penyimpanan yang lebih disukai oleh inokulum adalam dalam lemari es (tetapi bukan dalam freezer).

Bakteri hidup bisa ditambahkan pada tanah ((direct-soil application)) atau

diaplikasikan ke benih (seed-applied inoculant). Syarat-syarat inokulan rhizobium :

• Pembawa/carrier : gambut yang dinetralkan dg CaCO3 lolos saringan 200 mesh.

• Dikemas dalam plastik polietilen 0,05 mm

• Disterilisasi dengan sinar gama dosis 5,0 x 106 rads.

• Rhizobium dikulturkan dlm kaldu yeast manitol dg kepadatan 500 x 106

rhizobium hidup/ml.

• Kelembaban carrier 45 – 60 %.

• Diinkubasi 26oC selama 2 minggu.

• Disimpan dlm ruang suhu 4oC

• Standar Rhizobium pd inokulan 108 -109 sel hidup/g media

2.6.1. Aplikasi ke tanah (Direct-soil application)

Bentuk granular dari inokulum dapat ditempatkan dalam barisan benih melalui kotak insektisida atau melalui pupuk atau kotak benih (bersihkan kotak/box sebelum inokulum ditempatkan di dalamnya). Granul akan mengalir secara bebas melalui peralatan penanaman dan pengaliran inokulum ini sebaiknya dikalibrasi dan diukur. Konsentrasi liquid kultur inokulum yang dibekukan mungkin ditambah air agar mencair, kemudian tambahkan air ke dalam tangki untuk aplikasi penyemprotan ke dalam barisan benih. Inokulan sebaiknya tidak dicampur dengan pestisida atau pupuk jika diaplikasikan ke dalam barisan benih. Ketika benih tumbuh menjadi legum, dapat direkomendasikan bahwa pupuk dapat diaplikasikan sebagian. Aplikasi inokulan langsung ke dalam tanah sangat efektif.

Bagaimanapun, permukaan terbesar menjadi tertutup oleh inokulan memerlukan material yang lebih banyak. Hal ini terutama pada kasus ketika barisan kedelai ditanam terbatas. Akhirnya metode ini lebih mahal dibandingkan dengan inokulasi pada benih.

2.7.2 Aplikasi ke Benih (Seed-applied inoculant)

Inokulum yang akan dicampurkan ke dalam benih sebelum ditanam tersedia dalam bercam-macam carier/pembawa ; carier/pembawa yang umum adalah “peat”. (sejenis bahan organik). “Peat” menyediakan carier lebih baik dibandingkan carier lainnya melindungi kehidupan bakteria dibawah kondisi lingkungan yang tidak baik (tempertaur tinggi, keterlambatan penanaman). Inokulasi benih. Ketika benih diinokulsi, dua kondisi yang harus dijaga untuk memperoleh nodulasi yang baik : (1) akar harus kontak dengan bakteri Rhizobia dan (2) Rhizobia harus dalam kondisi hidup dan dapat menginfeksi akar tanaman.

Agar bakteria dapat kontak dengan akar tanaman, inokulum harus menutupi masingmasing benih. Untuk mencapai distribusi terbaik, inokulum seharusnya dicampurkan dengan benih dalam jumlah besar dibandingkan dismpan dalam kotak benih –menutupi lantai – dalam bak.

Gunakan bahan perekat (“sticker”) yang dapat membantu inokulan agar melekat pada masing-masing benih. Hal ini penting terutama pada benih legum yang sangat kecil, yang memerlukan lebih banyak inokulan per unit benih-area permukaan.

Perekat buatan sendiri dapat disediakan dengan pengenceran 1 -10 sirup atau molases, pengenceran cola atau susu dapat juga digunakan. Mencampurkan benih dan perekat secukupnya hanya untuk melembabkan semua benih. Terlalu cair dapat mengakibatakan perkecambahan yang prematur pada benih. Untuk melembabkan benih tambahkan inokulan pada lapisan benih. Pengeringan udara dengan menghamparkan benih pada kondisi teduh. Pengeringan bias dipercepat dengan menambahkan tambahan “peat” beralaskan inokulan atau batu kapur halus. Benih harus kering pada saat ditanam. Benih seharusnya sesegera mungkin ditanam setelah inokulasi sebab bakteria mulai mti pada proses pengeringan. Jika tidak ditanam dalam waktu 24 jam, inokulasi kembali.

Pre-inokulasi benih. Salah satu metode preinokulasi yang umum digunakan (1) meresapi (impregnation) Rhizobia dengan proses vakum atau (2) dibuat pil dengan

batu kapur halus. Tipe pil dari preinokulasi benih adalah umumnya lebih disukai pada penelitian dasar dan menunjukkan bahwa bakteria hidup lebih lama pada benih pil dan tipe preinokulasi benih menghasilan formasi jumlah nodula yang lebih banyak Preinokulasi benih seharusnya ditangani dengan cara yang sama seperti halnya paket inokulum. Beberapa tindakan pencegahan dapat menjamin hasil yang lebih baik. Mengecek kembali tanggal kadaluarsa pada kantong benih, penyimpanan dan tsimpan benih jangan dibawah sinar matahari langsung dan hindari panas dan tanam sesegera mungkin . Jika bakteria dipastikan dalm kondisi mati, inokulasi kembali benih. Jika air atau larutan perekat menyebabkan kandungan asam pada benih pil menjadi gum up, gunakan mineral oil (0.5 to 1.0 of oil per lb. of seed) untuk melekatkan inokulum baru pada benih.Tanam sesegera mungkin.

DAFTAR PUSTAKA

Aaron Fairc hild Azospirillium brasilianse.http://www . web.umr.edu. Diakses tanggal 11 Juni 2011.

Anke Beker. 2003. Symbiotic Plant-Microbe Interaction. www. cebitec.unibiefild.de.Dikases 1 Juni 2011.

Azotobacter.http://www.indiaagronet.com/indiaagronet/Manuers_fertilizers /azotoacter.htm. Diakses tanggal 11 Juni 2011.

Chen, Wen-Ming, James, Euan K., Coenye, Tom, Chou, Jui-Hsing, Barrios, Edmundo, deFaria, Sergio M., Elliott, Geoffrey N., Sheu, Shih-Yi, Sprent, Janet I., Vandamme,Peter. Burkholderia mimosarumsp. nov., isolated from root nodules of Mimosa spp. from Taiwan and South America. Int J Syst Evol Microbiol 2006 56: 1847-1851. Abstract

Davies, P.J. 1995. The Plant Hormones: Their nature, Occurance, and function. Di dalam Davies, P.J. (ed). Plant Hormones:Physiology, Biochemistry and Molecular Biology. Dordrecht: Kluwer Academic Publisers.

Hamdi, Y.A .. 2002. Application of Nitrogen fixing Systems in Soil Improvement andManagement. FAO and Agriculture Organization of The United Nations .FAO Soil Buletin. Rome.

Hindersah, R., & Setiawati, M.R. 1997. Upaya peningkatan efisiensi pemupukan N pada lahan marjinal dengan metode biologis dengan inikator tanaman tomat. Laporan Penelitian. Bandung: LP-UNPAD.

Hindersah, R., Arief, D.H. & Sumarni, Y. 2000. Kontribusi hormonal Azotobcter chroococcum pada pertumbuhankecambah jagung sistem kultur cair. Prosiding Seminar Nasional Bioteknologi Pertanian.

Hindersah, R., Arifin, M. & Rudiwan, Y. 2002a. Pengaruh asam humat dan supernatant Azotobacter chrococcum terhadap pertumbuhan bibit selada (Lactuca Sativa L.) pada Andisol. Makalah disampaikan pada Seminar Tahunan Himpunan Ilmu Tanah di Mataram.

Hindersah, R., Fitriatin, B.N. & Setiawati, M.R. 2003c. Azotobacter application in agricultural soil management. Proceeding International Conference on Environment and urban management.

Hindersah, R., Kalay, A.M. & Setiani Muntalif, B. 2003 a. Pemanfaatan lumpur instalasi pengolahan limbah domestik: Studi pendahuluan terhadap pertumbuhan vegetatif jagung manis (Zea mays L. var. saccharata ) dan mikroba tanah. Makalah disampaikan pada Seminar Persatuan Mikrobiologi Indonesia, 29-30 Agustus 2003 di Bandung

Impact I and Impact II : interactions between mic robial inoculants and resident populations in the rhizosphere of agronomically important crops in typical soils http://www.ec.europa.eu . Diakses tanggal 11 Juni 2011.

R.E. Hulbert . 1999. Soil M icrobiology and Elec tive Culture Tehnique. www.slic2.edu

Shantharam, S. & Mattoo, A.K. 1997. Enhancing biological nitrogen fixation: An appraisal of current and alternative technologies for N input into plants. Plant and Soil 194: 205-216.

Valverde, Angel, Igual, Jose M., Peix, Alvaro, Cervantes, Emilio, Velazquez, Encarna. Rhiz obium lusitanum sp. nov. a bacterium that nodulates Phaseolus vulgaris. Int J Syst Evol Microb iol 2006 56: 2631-2637. Abstract